医药生物技术国家重点实验室（鼓楼医院）蒋青教授课题组最近研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）的软骨抑制和骨关节炎（OA）易感基因的异常表观遗传修饰对OA发展有显着贡献;然而，潜在的机制仍不清楚。同时，我们证明由内侧半月板失稳术引起的人和小鼠OA软骨中的PPARγ抑制基本上由异常的DNA甲基转移酶DNMT1/DNMT3a增加和相关的PPARγ启动子高甲基化引起。此外，DNMT1 / DNMT3a的药理学抑制可以有效地使PPARγ启动子去甲基化，减少PPARγ抑制和减轻PPARγ依赖性地OA小鼠的软骨损伤，而且，通过DNA去甲基化使PPARγ不被抑制在治疗OA和相关关节疾病方面具有治疗潜力。该项研究“PPAR gamma preservation via promoter demethylation alleviates osteoarthritis in mice”于近日发表在Annals of the Rheumatic Diseases上。
骨关节炎(OA)是老年人最常见的退行性关节疾病，其发生发展受多种OA易感基因表观遗传修饰异常影响;然而，DNA甲基化紊乱影响骨关节炎的确切病理机制尚未明确。本课题研究了PPARγ(氧化物酶体增殖物激活受体伽玛，Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)表观遗传抑制在骨关节炎发展中的重要作用。已有文献研究表明，在骨关节炎发病过程中，关节软骨中的过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）明显下调，同时，PPARγ是软骨细胞内一种重要的抗炎抗氧化应激蛋白，具有重要的软骨保护功能。但是骨关节炎发生过程中，PPARγ下调的原因目前却没有研究清楚。该研究巧妙地抓住这一点，从上游做起，着重探讨PPARγ下调的原因。该研究在骨关节炎软骨临床样本和小鼠模型中均发现了PPARγ下降，更为关键的是，同时发现了其伴随的启动子表观遗传学修饰（DNA甲基化）异常改变，同时调控软骨中表观遗传学修饰（DNA甲基化）可以缓解骨关节炎的进展。由此推测骨关节炎过程中表观遗传学修饰（DNA甲基化）导致了PPARγ的下调。
本课题通过测定OA患者和内侧半月板失稳术（DMM）小鼠OA模型中关节软骨PPARγ和DNA甲基转移酶(DNMTs)的表达，通过甲基化特异性PCR和亚硫酸氢盐PCR测序法评估人和小鼠PPARγ启动子甲基化状态，比较药理性DNA去甲基制剂5Aza对野生型小鼠和PPARγ基因敲除小鼠骨关节炎的保护作用差异。
主要实验结果如下：
1：DNMT1和DNMT3a升高引起PPARγ启动子DNA高甲基化从而抑制PPARγ表达
图1：（A）三个骨关节炎（OA）患者和四个对照的人的软骨以及假手术和内侧半月板失稳手术的小鼠的DNA甲基转移酶（DNMT）DNMT1，DNMT3a和DNMT3b的蛋白质印迹分析。（B）Sham或DMM小鼠的DNMT1，DNMT3a和DNMT3b的软骨免疫组织化学染色。箭头指示阳性染色的软骨细胞。（C）人和小鼠PPARγ启动子的示意图。相对于转录起始位点，描绘了CpG岛（灰色区域）和甲基化特异性PCR（MSP）/亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）引物的位置。同时显示了鸟嘌呤和胞嘧啶（GC）含量。（D）细胞MSP分析。用琼脂糖凝胶电泳分析用IL-1β（10ng / mL）和/或5Aza（10μM）处理24小时的培养的人SW1353软骨细胞（左图）和小鼠原代软骨细胞（右图）的代表性MSP产物。（E）正常对照和OA患者以及Sham，5Aza处理，DMM和5Aza处理的DMM小鼠的软骨MSP分析。（F）Sham，5Aza处理，DMM和5Aza处理的DMM小鼠的软骨BSP分析。将每组三只随机选择的小鼠（M1，M2和M3）进行BSP分析。将PCR产物克隆到质粒中，对每只动物的5个克隆进行测序。一个盒子代表一只老鼠。方框中的每行点代表一个单一的测序克隆，每个点代表一个CpG位点。空点或暗点分别表示未甲基化或甲基化的CpG。
2：5Aza能解除PPARγ的抑制并预防小鼠的OA发病机制
图2：C57BL/6小鼠分成Sham，5Aza处理（每天0.35mg / kg腹膜内注射），内侧半月板失稳（DMM）和5Aza处理的DMM组处理10周和15周。（A）番红O /快速绿色（上图和中图）或番红O /苏木精（下图）染色的膝关节切片照片。箭头表示受损的软骨（红色），内侧半月板附近发炎的滑膜（深色）或增厚软骨下骨板（SBP，黄色）。中间面板的图像是上面板的方格区域。（B）骨关节炎参数的定量。软骨损伤，滑膜炎评分和SBP厚度的OARSI评分。（C）Sham，DMM和5Aza处理的小鼠关节组织的PPARγ，MMP13，Aamts5，Aggrecan和Collagen2的Western印迹分析（10周）。（D）C图的定量。
3：在体内5Aza 在PPARγ对于软骨保护的作用中至关重要
图3：（A）番红O /快速绿色染色的膝关节切片的代表性显微照片。箭头表示受损的软骨。下面板是上面板关节软骨的方框区域。（B）通过OARSI评分定量软骨损伤。（C）小鼠关节组织的Aamts5，MMP13，Aggrecan和Collagen2蛋白的Western印迹图。（D）图6C的量化。（E）小鼠关节组织的PPARγ，SOD2和过氧化氢酶表达蛋白质印迹图。（F）图6E的定量。（G）对小鼠关节组织IL-1β和TNF-α的mRNA水平的定量实时PCR分析。对于（C）和（E）中的蛋白质印迹，仅显示来自每组的两个随机选择的样品。所有定量（B，D，F和G）表示为所有动物样品的平均值±SEM; N = 6。
结果发现PPARγ在OA患者和DMM小鼠关节软骨中表达下降， 可能是DNMT1 和DnMT3a的异常升高和PPARγ启动子超甲基化导致。DnMT1和DnMT3a抑制剂5Aza能够逆转骨关节炎小鼠的PPARγ启动子超甲基化，缓解PPARg下调并有效减轻小鼠骨关节炎的软骨损伤。5Aza还能抑制骨软骨细胞关节炎相关炎性细胞因子的过度表达和抗氧化剂酶的低表达，但其保护作用在PPARγ基因敲除小鼠骨关节中显著减弱。
据此我们得出结论，PPARγ的表观遗传抑制骨关节炎发展的重要诱因，通过DNA去甲基化制剂能够有效发挥抗OA作用。这个发现对临床骨关节炎和相关关节疾病的治疗具有广阔的应用前景。该研究通过实例，进一步证实了基因表达的表观遗传调控在骨关节炎发病机制中的重要性。人在漫长生命过程中一系列的危险因素的累积虽不至于改变基因的碱基序列，但可以通过中DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNAs等表观遗传学修饰的改变影响疾病进展。表观遗传学平衡的打破导致关节软骨中基质降解蛋白酶、细胞因子、转录因子、胶原和蛋白多糖等特异性基因的的异常表达。这些基因的异常表达可能会破坏分解代谢和合成代谢的平衡，破坏软骨内环境的稳定，导致软骨降解。未来需要进一步的研究以确定在骨关节炎发生和发展过程中，触发表观遗传事件的最重要的特定危险因素是什么？以及不同基因乃至不同表观遗传机制之间的相互作用对骨关节炎的发生发展起到了什么样的作用？只有这样我们才能对骨关节炎发病过程中表观遗传学起到的作用有深刻的理解，并将此转化为治疗的新靶点。
文章的第一作者为蒋青课题组的朱晓波硕士。该研究得到了国家自然科学基金（NSFC81730067,81670762,81470940和81420108021）经费的支持，特别感谢南京大学医药生物技术国家重点实验室。
原文链接请见：https://ard.bmj.com/content/78/10/1420.full